In vivo and in vitro investigation of the tissue-specific activity of the human CYP3A4 and CYP3A5 promoters

The human cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), the predominant but variably expressed cytochrome P450 in adult liver and small intestine is involved in the metabolism of over 50% of currently used drugs. Its paralog CYP3A5 plays a crucial role in the disposition of several drugs with low therapeutic index, including tacrolimus. Limited information is available for the CYP3A5 transcriptional regulation and its induction by xenobiotics remains controversial. In the first part of this study, we analysed the CYP3A5 transcriptional regulation and its induction by xenobiotics in vivo using transgenic mice. To this end, two transgenic strains were established by pronuclear injection of a plasmid, expressing firefly luciferase driven by a 6.2 kb of the human CYP3A5 promoter. A detailed analysis of both strains shows a tissue distribution largely reflecting that of CYP3A5 transcripts in humans. Thus, the highest luciferase activity was detected in the small intestine, followed by oesophagus, testis, lung, adrenal gland, ovary, prostate and kidney. However, no activity was observed in the liver. CYP3A5-luc transgenic mice were similarly induced in both sexes with either PCN or TCPOBOP in small intestine in a dose-dependent manner. Thus, the 6.2 kb upstream promoter of CYP3A5 mediates the broad tissue activity in transgenic mice. CYP3A5 promoter is inducible in the small intestine in vivo, which may contribute to the variable expression of CYP3A in this organ. rnThe hepato-intestinal level of the detoxifying oxidases CYP3A4 and CYP3A5 is adjusted to the xenobiotic exposure mainly via the xenosensor and transcriptional factor PXR. CYP3A5 is additionally expressed in several other organs lacking PXR, including kidney. In the second part of this study, we investigated the mechanism of the differential expression of CYP3A5 and CYP3A4 and its evolutionary origin using renal and intestinal cells, and comparative genomics. For this examination, we established a two-cell line models reflecting the expression relationships of CYP3A4 and CYP3A5 in the kidney and small intestine in vivo. Our data demonstrate that the CYP3A5 expression in renal cells was enabled by the loss of a suppressing Yin Yang 1 (YY1)-binding site from the CYP3A5 promoter. This allowed for a renal CYP3A5 expression in a PXR-independent manner. The YY1 element is retained in the CYP3A4 gene, leading to its suppression, perhaps via interference with the NF1 activity in renal cells. In intestinal cells, the inhibition of CYP3A4 expression by YY1 is abrogated by a combined activating effect of PXR and NF1 acting on their respective response elements located adjacent to the YY1-binding site on CYP3A4 proximal promoter. CYP3A4 expression is further facilitated by a point mutation attenuating the suppressing effect of YY1 binding site. The differential expression of CYP3A4 and CYP3A5 in these organs results from the loss of the YY1 binding element from the CYP3A5 promoter, acting in concert with the differential organ expression of PXR, and with the higher accumulation of PXR response elements in CYP3A4. rn

Synthese und Charakterisierung von HPMA-stabilisierten Kolloiden sowie deren Evaluierung in vitro und in vivo

Nanodimensionale Wirkstoff-Trägersysteme sind in der Lage, sowohl die Bioverfügbarkeit als auch das pharmakokinetische Profil von Wirkstoffen drastisch zu verbessern. Hauptgründe dafür sind eine erhöhte Plasma-Halbwertszeit durch die größenbedingte verminderte renale Ausscheidung und eine gesteigerte Anreicherung im Tumorgewebe durch den EPR-Effekt. Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Entwicklung neuer kolloidaler Wirkstoff-Trägersysteme, welche biokompatibel, teilweise bioabbaubar und funktionalisierbar sind. Ein Fluoreszenzfarbstoff wurde als hydrophobes Wirkstoffmodell eingekapselt. Wohldefinierte, eng verteilte und funktionalisierbare HPMA-basierte Block- und statistische Copolymere unterschiedlicher Molekulargewichte (10-25 kDa) und hydrophiler/hydrophober Zusammensetzung (10-50 mol%) wurden mittels RAFT- Polymerisation in Kombination mit dem Reaktivesteransatz hergestellt und in Miniemulsionsprozesse eingesetzt, um ihre Stabilisierungseffizienz zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass die kleineren Copolymere (10 kDa) mit einem Einbau von 10 mol% LMA, sowohl im Modellsystem Polystyrol, als auch im bioabbaubaren PDLLA-System, besonders geeignet sind und ergaben monodisperse Kolloide im Größenbereich von 100 bis 300 nm. Die kolloidalen Systeme zeigten keine Wirkung auf die Zellviabilität. In Folge dessen wurde das Aggregationsverhalten in humanem Blutserum mittels DLS untersucht, wobei keine Interaktion mit Blutbestandteilen festgestellt werden konnte. Zellaufnahmestudien wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, um das Schicksal der Kolloide in vitro zu untersuchen. Dabei wurden Kernmaterial, Hülle und das hydrophobe Wirkstoffmodell durch unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung getrennt betrachtet. Das hydrophobe Wirkstoffmodell wurde allein durch Interaktion der Kolloide mit den Zellen übertragen, was für eine diffusionsbedingte, initiale, aber unspezifische Freisetzung spricht. Eine solche Freisetzungskinetik kann durch Verwendung von Nitroglycerin, als vasodilatierender Wirkstoff mit geringer unspezifischer Wirkung, ausgenutzt werden, um den EPR-Effekt zu unterstützen. Die Aufnahme des Partikels hingegen geschieht zeitverzögert. Das Schicksal der Kolloide (sowohl des Kern- und desrnHüllmaterials) wurde durch doppelte Fluoreszenzmarkierung untersucht. Dabei kam es zu einer intrazellulären Ablösung der stabilisierenden Block-Copolymere zwischen 8 und 24 h. Nach Aufklärung der Aufnahme- und Freisetzungskinetiken wurde nun die Körperverteilung der PS- und PDLLA-Kolloide nach 18F-Markierung mittels PET und ex vivo-Biodistributiosstudien untersucht. Dabei hatte das Kernmaterial einen Einfluss auf die Körperverteilung. PET-Studien in Mäusen zeigten, dass die stabilisierenden Block-Copolymere beider Kolloide ein starkes Signal in der Niere geben, wobei das der PS-Kolloide weiter ausgeprägt war. Darüber hinaus war eine Anreicherung dieser in Lunge, Leber und Milz festzustellen. Die Verdrängung der stabilisierenden Polymere durch die Interaktion mit Blutbestandteilen erklärt dabei das erhöhte Nieren- und Blasensignal der PS- Kolloide. Das Anreicherungsmuster der PDLLA-Kolloide hingegen zeigte neben der Nierenakkumulation eine erhöhte Blutaktivität und somit die gewünschten langzirkulierenden Eigenschaften. Diese Ergebnisse konnten auch mittels ex vivo- Biodistributionsstudien bestätigt werden. Um die Tumoranreicherung weiter zu verbessern wurde die Verwendung von Folat als Erkennungsstruktur am einfachen HPMA-Polymer untersucht. Die Konjugate zeigten eine erhöhte Anreicherung im Vergleich zu den Polymeren ohne Erkennungsstrukturen. Blockadestudien bestätigten die Selektivität der Anreicherung. Diese Daten zeigen das Potential der Folat-Erkennungsstruktur in vivo innerhalb kurzer Zeitfenster, welche nun auf kolloidale Systeme übertragen werden kann.